Без рубрики

Реферат дослідження в гістології

15.12.2017
Реферат дослідження в гістології

Реферат: Дослідження в гістології

Для прогресу гістології, цитології та ембріології велике значення має

впровадження досягнень фізики і хімії, нових методів суміжних наук — біохімії,

молекулярної біології, генної інженерії.

Сучасні методи дослідження дозволяють вивчати тканини не тільки як єдине

ціле, але і виділяти з них окремі типи клітин для вивчення їх

життєдіяльності протягом тривалого часу, виділяти окремі клітинні

органели і складові їх макромолекули (наприклад, ДНК), досліджувати їх

Такі можливості відкрилися в зв’язку зі створенням нових приладів і технологій —

різних типів мікроскопів, комп’ютерної техніки, рентгеноструктурного

аналізу, застосування методу ядерно-магнітного резонансу (ЯМР), радіоактивних

ізотопів і авторадиографии, електрофорезу і хроматографії, фракціонування

клітинного вмісту за допомогою ультрацентрифугирования, поділу та

культивування клітин, отримання гібридів; використання біотехнологічних

методів — отримання гібридом і моноклональних антитіл, рекомбінантних ДНК і

Таким чином, біологічні об’єкти можна вивчати на тканинному, клітинному,

субклітинному і молекулярному рівнях. Незважаючи на впровадження в природні

науки різноманітних біохімічних, біофізичних, фізичних і

технологічних методів, необхідних для вирішення багатьох питань, пов’язаних з

життєдіяльністю клітин і тканин, гістологія в основі своїй залишається

морфологічної наукою зі своїм набором методів. останні дозволяють

охарактеризувати процеси, що відбуваються в клітинах і тканинах, їх структурні

Головними етапами цитологічного і гістологічного аналізу є вибір

об’єкта дослідження, підготовка його для вивчення в мікроскопі, застосування

методів микроскопирования, якісний і кількісний аналіз зображень.

Об’єктами дослідження служать живі і фіксовані клітини і тканини, їх

зображення, отримані в світлових і електронних мікроскопах або на

телевізійному екрані дисплея. Існує ряд методів, що дозволяють проводити

аналіз зазначених об’єктів.

Методи микроскопирования гістологічних препаратів

Основними методами вивчення біологічних мікрооб’єктів є світлова та

електронна мікроскопія, які широко використовуються в експериментальній і

Микроскопирование — основний метод вивчення мікрооб’єктів, який використовується в

біології більше 300 років. З моменту створення і застосування перших мікроскопів вони

постійно вдосконалювалися. Сучасні мікроскопи представляють собою

різноманітні складні оптичні системи, що володіють високою роздільною

здатністю. Розмір найменшої структури, яку можна бачити в

мікроскопі, визначається найменшим вирішуються відстанню (do),

яке в основному залежить від довжини хвилі світла (&# 955;) і довжини хвиль

електромагнітних коливань потоку електронів і ін. Ця залежність наближено

визначається формулою do = 1/2&# 955; Таким чином, чим менше довжина

хвилі, тим менше разрешаемое відстань і тим менші за розмірами

мікроструктури можна бачити в препараті. Для вивчення гістологічних

препаратів застосовують різноманітні види світлових мікроскопів та електронні

Світлова мікроскопія. Для вивчення гістологічних мікрооб’єктів

застосовують звичайні світлові мікроскопи і їх різновиди, в яких

використовуються джерела світла з різними довжинами хвиль. У звичайних світлових

мікроскопах джерелом освітлення служить природний або штучний світло.

Мінімальна довжина хвилі видимої частини спектра дорівнює приблизно 0,4 мкм.

Отже, для звичайного світлового мікроскопа найменше разрешаемое

відстань дорівнює приблизно 0,2 мкм (d0 = ½ * 0,4 мкм =

0,2 мкм), а загальне збільшення (твір збільшення об’єктива на збільшення

окуляра) може бути 1500-2500.

Таким чином, в світловому мікроскопі можна бачити не тільки окремі клітини

розміром від 4 до 150 мкм, а й їх внутрішньоклітинні структури — органели,

включення. Для посилення контрастності мікрооб’єктів застосовують їх фарбування.

Ультрафіолетова мікроскопія. Це різновид світлової мікроскопії. В

ультрафіолетовому мікроскопі використовують більш короткі ультрафіолетові промені з

довжиною хвилі близько 0,2 мкм. Разрешаемое відстань тут в 2 рази менше, ніж в

звичайних світлових мікроскопах, і становить приблизно 0,1 мкм (d0

= ½ * 0,2 мкм = 0,1 мкм). Отримане в ультрафіолетових променях невидиме

оком зображення перетвориться у видиме за допомогою реєстрації на

фотоплатівці або шляхом застосування спеціальних пристроїв (люмінесцентний екран,

Флюоресцентная (люмінесцентна) мікроскопія. явища флюоресценції

полягають в тому, що атоми і молекули ряду речовин, поглинаючи короткохвильові

промені, переходять в збуджений стан. Зворотний перехід із збудженого

стану в нормальне відбувається з випусканням світла, але з більшою довжиною

хвилі. У флюоресцентної мікроскопі в якості джерел світла для збудження

флюоресценції застосовують ртутні або ксенонові лампи надвисокого тиску,

що володіють високою яскравістю в області спектра 0,25-0,4 мкм (ближні

ультрафіолетові промені) і 0,4-0,5 мкм (синьо-фіолетові промені). довжина світловий

хвилі флюоресценції завжди більше довжини хвилі збуджуючого світла, тому їх

поділяють за допомогою світлофільтрів і вивчають зображення об’єкта тільки в світлі

флюоресценції. Розрізняють власну, або первинну, і наведену, або

вторинну, флюоресценцію. Будь-яка клітина живого організму володіє власною

флюоресценцией, проте вона часто буває надзвичайно слабкою.

Первинною флюоресценцией мають серотонін, катехол-ни (адреналін,

норадреналін), що містяться в нервових, здорових та інших клітинах, після фіксації

тканин в парах формальдегіду при 60-80 ° С (Метод Фалька).

Вторинна флюоресценція виникає при обробці препаратів спеціальними

Існують різні флюорохромами, які специфічно зв’язуються з

певними макромолекулами (акридин помаранчевий, родамін, флюоресцеин і ін.).

Наприклад, при обробці препаратів найчастіше вживається флюорохром

акридіновий помаранчевий. В цьому випадку ДНК і її сполуки в клітинах мають

яскраво-зелене, а РНК і її похідні — яскраво-червоне свічення. Таким чином,

спектральний склад випромінювання несе інформацію про внутрішню будову об’єкта і

його хімічний склад. Варіант методу флюоресцентної мікроскопії, при якому

і збудження, і випромінювання флуоресценції відбуваються в ультрафіолетовій області

спектра, отримав назву методу ультрафіолетової флюоресцентной

Фазовоконтрастна мікроскопія. Цей метод служить для отримання

контрастних зображень прозорих і безбарвних живих об’єктів, невидимих ​​при

звичайних методах микроскопирования. Як уже зазначалося, в звичайному світловому

мікроскопі необхідна контрастність структур досягається за допомогою

фарбування. Метод фазового контрасту забезпечує контрастність досліджуваних

нефарбованих структур за рахунок спеціальної кільцевої діафрагми, що поміщається в

конденсорі, і так званої фазової пластинки, що знаходиться в об’єктиві. така

конструкція оптики мікроскопа дає можливість перетворити які не сприймаються

оком фазові зміни пройшов через незабарвлений препарат світла в

зміна його амплітуди, тобто яскравості одержуваного зображення. підвищення

контрасту дозволяє бачити все структури, що розрізняються за показником

заломлення. Різновидом методу фазового контрасту є метод

фазово-темнопольного контрасту, що дає негативний порівняно з позитивним

фазовим контрастом зображення.

Мікроскопія в темному полі. У темнопольному мікроскопі тільки світло, який

дає дифракцию структур в препараті, досягає об’єктива. відбувається це

завдяки наявності в мікроскопі спеціального конденсора, який висвітлює

препарат строго косим світлом; промені від освітлювача направляються збоку. Таким

чином, поле виглядає темним, а дрібні частинки в препараті відбивають світло,

який далі потрапляє в об’єктив. Дозвіл цього мікроскопа не може бути

краще, ніж у светлопольного мікроскопа, так як використовується така ж довжина

хвилі. Але тут досягається більший контраст. Він використовується для вивчення

живих об’єктів, авторадіографіческімі об’єктів, наприклад зерен срібла, які

виглядають світлими на темному полі. У клініці його застосовують для вивчення

кристалів в сечі (сечова кислота, оксалати), для демонстрації спирохет, в

Зокрема treponema pallidum, що викликає сифіліс та ін.

Інтерференційна мікроскопія. Різновидами фазово-контрастного

мікроскопа є інтерференційний мікроскоп, який призначений для

кількісного визначення маси тканини, і диференційний інтерференційний

мікроскоп (з оптикою Номарського), який спеціально використовують для вивчення

рельєфу поверхні клітин та інших біологічних об’єктів.

У інтерференційному мікроскопі пучок світла від освітлювача розділяється на два

потоку: один проходить через об’єкт і змінює по фазі коливання, другий йде,

минаючи об’єкт. У призмах об’єктива обидва пучка з’єднуються і інтерферують між

собою. В результаті будується зображення, в якому ділянки мікрооб’єкту

різної товщини і щільності розрізняються за ступенем контрастності. провівши

кількісну оцінку змін, визначають концентрацію і масу сухого

Фазово-контрастний і інтерференційний мікроскопи дозволяють вивчати живі

клітини. У них використовується ефект інтерференції, що виникає при комбінації

двох наборів хвиль, який створює зображення мікроструктур. перевагою

фазово-контрастної, інтерференційної і темнопольной мікроскопії є

можливість спостерігати клітини в процесі руху і мітозу. При цьому

реєстрація руху клітин може проводитися за допомогою цейтраферной

Поляризаційна мікроскопія. Поляризаційний мікроскоп є

модифікацією світлового мікроскопа, в якому встановлені два поляризаційних

фільтра — перший (поляризатор) між пучком світла, і об’єктом, а другий

(Аналізатор) між лінзою об’єктива і оком. Через перший фільтр світло проходить

тільки в одному напрямку, другий фільтр має головну вісь, яка

розташовується перпендикулярно першому фільтру, і він не пропускає світло.

Виходить ефект темного поля. Обидва фільтра можуть обертатися, змінюючи

напрямок пучка світла. Якщо аналізатор повернути на 90 ° по відношенню до

поляризатора, то світло проходити через них не буде. Структури, які містять

поздовжньо орієнтовані молекули (колаген, мікротрубочки, мікрофіламенти), і

кристалічні структури (в клітинах Лейдіга) при зміні осі обертання

проявляються як світяться. Здатність кристалів або паракрісталліческіх

утворень до роздвоєння світлової хвилі на звичайну і перпендикулярну до

ній називається подвійне променезаломлення. Таку здатність мають фібрили

Електронна мікроскопія. Великим кроком вперед у розвитку техніки

мікроскопії були створення і застосування електронного мікроскопа (див. рис. 1, Б).

В електронному мікроскопі використовується потік електронів з більш короткими, ніж в

світловому мікроскопі, довжинами хвиль. При напрузі 50000 В довжина хвилі

електромагнітних коливань, що виникають при русі потоку електронів в

вакуумі, дорівнює 0,0056 нм. Теоретично розраховано, що разрешаемое відстань в

цих умовах може бути близько 0,002 нм, або 0,000002 мкм, тобто в 100 000 разів

менше, ніж в світловому мікроскопі. Практично в сучасних електронних

мікроскопах разрешаемое відстань складає близько 0,1-0,7 нм.

В даний час широко використовуються трансмісійні (просвічують)

електронні мікроскопи (ТЕМ) і скануючі (растрові) електронні мікроскопи

(СЕМ). За допомогою ТЕМ можна отримати лише площинне зображення досліджуваного

мікрооб’єкту. Для отримання просторового уявлення про структури

застосовують СЕМ, здатні створювати тривимірне зображення. растровий

електронний мікроскоп працює за принципом сканування електронним

микрозондом досліджуваного об’єкта, т. е. послідовно «обмацує» гостро

сфокусованим електронним пучком окремі точки поверхні. для

дослідження обраної ділянки микрозонд рухається по його поверхні під

дією відхиляють котушок (принцип телевізійної розгортки). таке

дослідження об’єкта називається скануванням (зчитуванням), а малюнок, по

якому рухається микрозонд, — растром. Отримане зображення виводиться на

телевізійний екран, електронний промінь якого рухається синхронно з

Головними перевагами растрової електронної мікроскопії є велика

глибина різкості, широкий діапазон безперервного зміни збільшення (від

десятків до десятків тисяч разів) і висока роздільна здатність.

Електронна мікроскопія за методом заморожування — сколювання застосовується

для вивчення деталей будови мембран і міжклітинних з’єднань. для

виготовлення відколів клітини заморожують при низькій температурі (-160 ° С). при

дослідженні мембрани площину відколу проходить через середину бислоя ліпідів.

Далі на внутрішні поверхні отриманих половинок мембран напилюють метали

(Платина, паладій, уран), вивчають їх за допомогою ТЕМ і мікрофотографії.

Метод Кріоелектронний мікроскопії. Швидко заморожений тонкий шар (близько

100 нм) зразка тканини поміщають на мікроскопічну грати і досліджують в

вакуумі мікроскопа при -160 ° С.

Метод електронної мікроскопії «заморожування — травлення» застосовують для

вивчення зовнішньої поверхні мембран клітин. Після швидкого заморожування

клітин при дуже низькій температурі блок розколюють лезом ножа. Утворені

кристали льоду видаляють шляхом сублімації води в вакуумі. Потім ділянки клітин

відтіняють, напиляя тонку плівку важкого металу (наприклад, платини). метод

дозволяє виявляти тривимірну організацію структур.

Таким чином, методи заморожування — сколювання і заморожування — травлення

дозволяють вивчати нефіксовані клітини без освіти в них артефактів,

Методи контрастування солями важких металів дозволяють досліджувати в

електронному мікроскопі окремі макромолекули — ДНК, великих білків

(Наприклад, міозин). При негативному контрастировании вивчають агрегати

макромолекул (рибосоми, віруси) або білкові філаменти (Актинові нитки).

Електронна мікроскопія ультратонких зрізів, отриманих методом

кріоул’тра-мікротомів. При цьому методі шматочки тканин без фіксації і

заливки в тверді середовища швидко охолоджують в рідкому азоті при температурі -196

° С. Це забезпечує гальмування метаболічних процесів клітин і перехід води

з рідкої фази в тверду. Далі блоки ріжуть на ультрамікротоме при низькій

температурі. Такий метод приготування зрізів зазвичай використовують для визначення

активності ферментів, а також для проведення иммунохимических реакцій. для

виявлення антигенів застосовують антитіла, пов’язані з частками колоїдного

золота, локалізацію якого легко виявити на препаратах.

Методи сверхвисоковольтной мікроскопії. Використовують електронні мікроскопи

з прискорює напругою до 3 000 000 В. Перевага цих мікроскопів в тому,

що вони дозволяють досліджувати об’єкти великої товщини (1-10 мкм), так як при

високої енергії електронів вони менше поглинаються об’єктом. стереоскопічна

зйомка дозволяє отримувати інформацію про тривимірної організації внутрішньоклітинних

структур з високою роздільною здатністю (близько 0,5 нм).

Рентгеноструктурний аналіз. Для вивчення структури макромолекул на

атомарному рівні застосовують методи з використанням рентгенівських променів, що мають

довжину хвилі близько 0,1 нм (діаметр атома водню). Молекули, що утворюють

кристалічну решітку, вивчають за допомогою дифракційних картин, які

реєструють на фотопластинці у вигляді безлічі плям різної інтенсивності.

Інтенсивність плям залежить від здатності різних об’єктів в решітці

розсіювати випромінювання. Положення плям в дифракційної картині залежить від

положення об’єкта в системі, а їх інтенсивність свідчить про його

внутрішньої атомну структуру.

Методи дослідження фіксованих клітин і тканин

Дослідження фіксованих клітин і тканин. основним об’єктом

дослідження є гістологічні препарати, приготовані з

фіксованих структур. Препарат може являти собою мазок (наприклад,

мазок крові, кісткового мозку, слини, цереброспинальной рідини та ін.),

відбиток (наприклад, селезінки, тимуса, печінки), плівку з тканини (наприклад,

сполучної або очеревини, плеври, м’якої мозкової оболонки), тонкий зріз.

Найбільш часто для вивчення використовується зріз тканини або органу. гістологічні

препарати можуть вивчатися без спеціальної обробки. Наприклад, приготований

мазок крові, відбиток, плівка або зріз органу можуть відразу розглядатися під

мікроскопом. Але внаслідок того, що структури мають слабкий контраст, вони погано

виявляються в звичайному світловому мікроскопі і потрібне використання спеціальних

мікроскопів (фазово-контрастні і ін.). Тому частіше застосовують спеціально

Процес виготовлення гістологічного препарату для світлової та електронної

мікроскопії включає наступні основні етапи: 1) взяття матеріалу і його

фіксація, 2) ущільнення матеріалу, 3) приготування зрізів, 4) фарбування або

контрастування зрізів. Для світлової мікроскопії необхідний ще один етап —

висновок зрізів в бальзам або інші прозорі середовища (5). фіксація

забезпечує запобігання процесів розкладання, що сприяє збереженню

цілісності структур. Це досягається тим, що взятий з органу маленький

зразок або занурюють в фіксатор (спирт, формалін, розчини солей важких

металів, осмієва кислота, спеціальні фіксуючі суміші), або піддають

термічній обробці. Під дією фіксатора в тканинах і органах відбуваються

складні фізико-хімічні зміни. Найбільш істотним з них є

процес незворотній коагуляції білків, внаслідок якого життєдіяльність

припиняється, а структури стають мертвими, фіксованими. фіксація

призводить до ущільнення і зменшення обсягу шматочків, а також до поліпшення

наступного фарбування клітин і тканин.

ущільнення шматочків, необхідне для приготування зрізів, проводиться

шляхом просочування попередньо зневодненого матеріалу парафіном,

целлоидин, органічними смолами. Більш швидке ущільнення досягається

застосуванням методу заморожування шматочків, наприклад в рідкої углекислоте.

Приготування зрізів проводиться на спеціальних приладах — мікротомів

(Для світлової мікроскопії) і ультрамікротомах (Для електронної

Фарбування зрізів (в світловій мікроскопії) або напилення їх солями металів (в

електронної мікроскопії) застосовують для збільшення контрастності зображення

окремих структур при розгляданні їх під мікроскопом. методи забарвлення

гістологічних структур дуже різноманітні і вибираються в залежності від завдань

дослідження. Гістологічні барвники поділяють на кислі, основні і

нейтральні. Як приклад можна привести найбільш відомий основний

барвник АЗУР II, який забарвлює ядра в фіолетовий колір, і кислий

барвник — еозин, що забарвлює цитоплазму в рожево-оранжевий колір.

Виборча спорідненість структур до певних барвників обумовлено їх

хімічним складом і фізичними властивостями. Структури, добре забарвлюються

кислими барвниками, називаються оксифільні (Ацидофільними,

еозинофільними), а забарвлюються основними — базофільними. структури,

сприймають як кислі, так і основні барвники, є

нейтрофіл’нимі (Гетерофільні). Пофарбовані препарати зазвичай зневоднюють в

спиртах зростаючої фортеці і прояснюють в ксилолі, бензолі, толуолі або

деяких маслах. Для тривалого збереження зневоднений гістологічний зріз

укладають між предметним і покривним склом в канадський бальзам або інші

речовини. Готовий гістологічний препарат може бути використаний для вивчення

під мікроскопом протягом багатьох років. Для електронної мікроскопії зрізи,

отримані на ультрамікротоме, поміщають на спеціальні сітки, контрастують

солями марганцю, кобальту та ін., після чого переглядають під мікроскопом і

фотографують. Отримані мікрофотографії служать об’єктом вивчення поряд з

Методи дослідження хімічного складу і метаболізму клітин і тканин

Для вивчення хімічного складу біологічних структур — локалізації

речовин, їх концентрації та динаміки в процесах метаболізму застосовують

спеціальні методи дослідження.

Цито- і гістохімічні методи. Ці методи дозволяють виявляти локалізацію

різних хімічних речовин в структурах клітин, тканин і органів — ДНК,

РНК, білків, вуглеводів, ліпідів, амінокислот, мінеральних речовин, вітамінів,

активність ферментів. Ці методи засновані на специфічності реакції між

хімічним реактивом і субстратом, що входять до складу клітинних і тканинних

структур, і фарбуванні продуктів хімічних реакцій. Для підвищення

специфічності реакції часто застосовують ферментативний контроль. Наприклад, для

виявлення в клітинах рибонуклеїнової кислоти (РНК) часто використовують

галлоціанін — барвник з основними властивостями, а наявність РНК підтверджують

контрольної обробкою рібонуклеазою, що розщеплює РНК. Галлоціанін

забарвлює РНК в синьо-фіолетовий колір. Якщо зріз попередньо обробити

рібонуклеазою, а потім пофарбувати галлоціаніном, то відсутність фарбування

підтверджує наявність у структурі рибонуклеїнової кислоти. опис

численних цито- і гістохімічних методів дається в спеціальних

В останні роки поєднання гістохімічних методів з методом електронної

мікроскопії призвело до розвитку нового перспективного напряму —

електронної гистохимии. Цей метод дозволяє вивчати локалізацію різних

хімічних речовин не тільки на клітинному, а й на субклітинному і

молекулярному рівнях. Для вивчення макромолекул клітин використовують дуже

чутливі методи із застосуванням радіоактивних ізотопів і антитіл,

що дозволяють виявити навіть невеликий вміст молекул (менше 1000).

Радіоактивні ізотопи при розпаді ядра випускають заряджені частинки (електрони)

або випромінювання (наприклад, гамма-промені), які можна зареєструвати в

спеціальних приладах. Радіоактивні ізотопи використовують в методі

радиоавтографии. Наприклад, за допомогою радіоізотопів 3Н-тимідину

досліджують ДНК ядра, за допомогою 3Н-уридину — РНК.

Метод радиоавтографии. Цей метод дає можливість найбільш повно вивчити обмін

речовин в різних структурах. В основі методу лежить використання радіоактивних

елементів (наприклад, фосфору — 32Р, вуглецю — 14С,

сірки — 35S, водню — 3H) або мічених ними сполук.

Радіоактивні речовини в гістологічних зрізах виявляють за допомогою

фотоемульсії, яку наносять на препарат і потім проявляють. У ділянках

препарату, де фотоемульсія стикається з радіоактивною речовиною, відбувається

фотореакція, в результаті якої утворюються засвічені ділянки (треки). цим

методом можна визначати, наприклад, швидкість включення мічених амінокислот в

білки, освіту нуклеїнових кислот, обмін йоду в клітинах щитовидної залози і

Методи иммунофлюоресцентного аналізу. Застосування антитіл. антитіла —

захисні білки, що виробляються плазмоцід (похідними В-лімфоцитів) у відповідь

на дію чужорідних речовин (антигенів). Кількість різних форм антитіл

досягає мільйона. Кожне антитіло має ділянки для «впізнавання» молекул,

викликали синтез цього антитіла. У зв’язку з високою специфічністю антитіл в

відношенні антигенів вони можуть бути використані для виявлення будь-яких білків

клітини. Для виявлення локалізації білків антитіла забарвлюють флюоресцирующими

барвниками, а потім клітини вивчають за допомогою флюоресцентної мікроскопії.

Антитіла можна використовувати також для вивчення антигенів на ультраструктурному

рівні за допомогою електронного мікроскопа. Для цього антитіла мітять

електронно-щільними частинками (мікросфери колоїдного золота). для посилення

специфічності реакції застосовують моноклональні антитіла, що утворюються лінією

клітин, — клонами, отриманої методом гібридом з однієї клітини. метод гібридом

дозволяє отримувати моноклональні антитіла з однаковою специфічністю і в

Методи иммунофлюоресцентного аналізу широко і ефективно використовуються в

сучасної гістології. Ці методи застосовуються для вивчення процесів

диференціювання клітин, виявлення в них специфічних хімічних сполук і

структур. Вони засновані на реакціях антиген — антитіло. кожна клітина

організму має специфічний антигенний склад, який головним чином

визначається білками. Продукти реакції можна фарбувати і виявляти в

люмінесцентному мікроскопі, наприклад виявлення актину і тубуліну в клітці з

допомогою методу иммунофлюоресцентного аналізу.

Сучасні методи досліджень дозволяють проводити аналіз хімічного

складу різних структурних компонентів клітин, як фіксованих, так і

живих. Вивчення окремих внутрішньоклітинних структур стало можливим після

розробки технологій фракціонування клітинного вмісту.

Джерело: Реферат: Дослідження в гістології

Реферат дослідження в гістології

Також ви можете прочитати